La secuenciación de RNA o RNA.Seq, es una técnica utilizada para analizar el transcriptoma completo de un organismo, permitiendo la identificación y cuantificación de todos los RNA presentes en una muestra en un momento dado. Tanto en la acuicultura como en la piscicultura, RNA-Seq ha sido empleado para estudiar la expresión génica asociada con el crecimiento, la salud, la respuesta al estrés y la resistencia a enfermedades en diversas especies acuáticas. No obstante, el análisis de datos de RNA-Seq implica desafíos para los investigadores requiriendo algunas habilidades en el manejo de herramientas bioinformáticas de código abierto, generalmente operativas en ambientes Linux. Este requerimiento técnico puede presentarse como una barrera significativa, ya que muchos investigadores en acuicultura y piscicultura aún no están familiarizados con estas herramientas. Este estudio comparó diversas herramientas bioinformáticas para el análisis de RNA-Seq utilizando datos obtenidos de muestras de cerebro de tilapia nilótica, una especie introducida y ampliamente utilizada en acuicultura y piscicultura en Colombia. El objetivo del estudio se centra en comparar herramientas licenciadas, de código abierto y plataformas en línea e identificar sus ventajas y desventajas, ofreciendo una perspectiva equilibrada y práctica para investigadores del sector acuícola, que buscan optimizar sus análisis bioinformáticos según sus necesidades y recursos disponibles. Este análisis se realizó comparando los módulos de control de calidad, preprocesamiento de datos y de análisis de RNA-Seq de CLC Genomics Workbench V 24.0 (Qiagen). De igual manera, se emplearon también herramientas de código abierto como FastQC, Trimmomatic, HISAT2, featureCounts, edgeR para replicar el análisis de RNA-Seq desde preprocesamiento hasta evaluación de la expresión diferencial. Se usó además la plataforma Web Galaxy, para acceder a varias de las herramientas bioinformáticas de código abierto, bajo su ambiente gráfico. Finalmente, se usaron las bases de datos y herramientas online de DAVID Bioinformatics, Panther Classification System y STRING para el análisis funcional final. La combinación de estas herramientas permitió un análisis exhaustivo de los datos de RNA-Seq aprovechando las fortalezas individuales y mitigando las debilidades de cada herramienta. En el caso del trabajo realizado en CLC Genomics Workbench, es una herramienta comercial reconocida por su interfaz amigable, con disponibilidad de módulos para realizar todas las fases del análisis, con un soporte técnico robusto, facilitando un análisis integral. No obstante, su uso implica un costo considerable y restricciones de licencias. En este estudio se obtuvieron resultados semejantes utilizando CLC Genomic Workbench, la plataforma Galaxy y el proceso mediante línea de comandos. Sin embargo, en cuanto a eficiencia y optimización del tiempo, CLC Genomic Workbench permite un rápido desarrollo del proceso. Por su parte, Galaxy se destacó por su plataforma en línea accesible y su integración de múltiples herramientas, aunque puede enfrentar limitaciones de rendimiento y disponibilidad, especialmente durante períodos de alta demanda. El trabajo en la terminal permite comprender con mayor claridad el flujo de trabajo y los parámetros requeridos en cada una de las herramientas bioinformáticas empleadas para el análisis de RNA-seq. Los resultados subrayan la importancia de seleccionar herramientas bioinformáticas adecuadas, considerando costos, accesibilidad, facilidad de uso, soporte técnico y las funcionalidades específicas requeridas. La experiencia adquirida destaca la relevancia de una formación continua y la adaptación a nuevas tecnologías en el campo de la bioinformática para lograr resultados precisos y eficientes en el análisis de RNA-Seq, que permitan fortalecer el campo de la investigación en las prácticas acuícolas.